2026-01-26 07:40:23

基于全基因组关联分析筛选冬季项目运动员睾酮水平相关遗传标记

1.2 研究方法

1.2.1 睾酮水平检测

在运动员常规训练周期的恢复期，清晨空腹采集静脉血5 ml，常温静置30 min后，于离心机（赛默飞，美国）内，转速3 500 rpm，离心10 min，分离血清和血细胞。血清用于睾酮浓度检测，血细胞用于后续DNA的提取。采用UniCel DxI 800 Access全自动化学发光免疫分析仪（贝克曼，美国）测试血清中的睾酮浓度，测试过程按照标准化操作流程进行。

1.2.2 DNA提取

采用磁珠法血液基因组提取试剂盒（天根生化科技，北京）提取运动员DNA，提取过程按照试剂盒操作说明书进行。提取完成后，采用1%琼脂糖凝胶电泳检验DNA质量，Nanodrop 2000检测DNA纯度，Qubit 4（赛默飞，美国）对DNA浓度进行定量。要求凝胶电泳主带清晰、无降解条带，样品OD值260/280大于1.8，Qubit浓度大于1 ng/μL，体积不小于20 μL。

1.2.3 全基因组芯片测试

质检合格的DNA样本，采用Infiniumm Chinese Genotyping_Array-24 v1.0 BeadChip芯片（因美纳，美国）进行全基因组的基因分型，依次经过制备MSA6板、MSA6板的片段化、沉淀MSA6板、重悬MSA6板、设置用于杂交的Multi BeadChip、杂交Multi BeadChip、清洗BeadChip、组装流通室、单碱基延伸、染色LCG BeadChip和BeadChip成像等步骤，最后采用GenomeStudio 2.0读取检测结果，并进行数据格式的转化。

1.2.4 全基因组测序

质检合格的DNA样本，采用NovaSeq 6000测序系统（因美纳，美国）进行测序深度为30×的全基因组测序，依次经过机械打断DNA片段、DNA片段纯化、DNA末端补平、末端连接Adapter、纯化Adapter、片段分选、文库扩增、文库质检、Illumina高通量测序等步骤完成检测。通过对原始fastq文件进行数据质控，数据预处理和变异检测，得到所有变异位点。

1.2.5 全基因组芯片、测序结果质控、基因型填充和合并

基因型填充前需对全基因组芯片测试结果、全基因组测序结果进行质控。芯片结果的质控条件为：排除掉位点、样本缺失率大于0.05，哈迪温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium ，HWE）小于1×10−7的位点和样本。测序结果的质控条件为：排除掉位点、样本缺失率大于0.1，哈迪温伯格平衡小于1×10−7的位点和样本。利用Eagle/Minimac4软件进行基因型填充，基因型填充参考面板为千人基因组计划（1 000 Genomes Project，1 kGP），填充条件为质量阈值R2＞0.7（即INFO＞0.7），芯片基因型填充后包含9 994 690个遗传变异位点，全基因组测序基因型填充后包含17 410 399个遗传变异位点。基因型填充后，对芯片和测序结果位点进行合并，得到包含190名冬季项目运动员的全基因组基因型数据（17 035 767个遗传变异位点）。

1.2.6 全基因组关联前的数据质控

采用PLINK1.9软件对填充后芯片数据进行质量控制，排除最小等位基因频率小于5%，HWE小于1×10−7，基因型缺失超过0.1的SNPs，基因型缺失率超过0.1的个体。通过质控保留的SNP位点为5 718 671个，采用质控后的SNPs进行后续GWAS分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0对数据进行统计分析。描述性统计结果以平均数±标准差（M±SD）表示。K-S法检验数据正态分布。对于不符合正态分布的数据，进行log10（x）对数转换。转换后若数据符合正态分布，则使用独立样本t检验进行不同类别运动员、不同基因型运动员的睾酮浓度均值的比较分析；若数据仍不符合正态分布，则使用转换前的数据进行Mann-Whitney U非参数检验。显著性水平界定为P＜0.05。GWAS分析前对人群分层进行PCA分析。应用PLINK1.9软件，以性别、运动项目以及PCA分析的前10个主成分作为协变量进行全基因组关联分析，筛选显著性SNPs，全基因组显著性设定为GWAS的标准阈值P＜5×10−8，提示性显著性设定为P＜1×10−5（Williams et al.，2021）。计算GWAS关联结果的膨胀系数（λ），以评价GWAS关联结果的偏倚情况以及是否受到群体分层的影响。采用R语言包CMplot进行GWAS曼哈顿图的绘制。采用3D SNP工具对全基因组显著性的SNPs进行生物功能注释。

2 研究结果

2.1 不同等级冬季项目运动员睾酮水平比较及分布

本研究将二级、一级运动员归类为普通运动员，将运动健将、国际级运动健将归类为精英运动员。结果显示，男性精英运动员的睾酮水平[（20.72±4.38）nmol/L]显著高于普通运动员[（19.06±4.13）nmol/L]（P=0.003）。女性精英运动员的睾酮水平[（2.01±0.67）nmol/L]显著高于普通运动员[（1.71±0.68）nmol/L]（P=0.002）（图1）。

男性精英运动员的睾酮水平符合正态分布（P=0.09），睾酮水平范围为14.04～35.65 nmol/L，男性普通运动员的睾酮水平也符合正态分布（P=0.20），睾酮水平范围为9.27～28.07 nmol/L。而女性精英运动员的睾酮水平不符合正态分布（P=0.01），睾酮水平范围为0.88～4.44 nmol/L，女性普通运动员的睾酮水平符合正态分布（P=0.20），睾酮水平范围为0.19～3.04 nmol/L（图2）。

2.2 冬季项目运动员睾酮水平的全基因组关联分析

2.3 ACADSB基因SNP基因频率

2.4 不同群体ACADSB基因6个SNPs的基因型间睾酮水平的差异

由于AA基因型受试者分布极少，在本研究中仅有1名AA基因型受试者，因此在比较不同群体基因型睾酮水平差异时，仅比较了aa基因型和Aa基因型受试者。统计结果发现，在冬季项目的男性运动员中，ACADSB基因6个SNPs的aa基因型的运动员睾酮浓度显著高于Aa基因型（P=0.014）；在冬季项目的女性运动员中，ACADSB基因6个SNPs的aa基因型的运动员睾酮浓度有高于Aa基因型运动员的趋势，但未达到统计学上的显著性（P=0.055）（表4）。

对于aa基因型，统计结果发现，冬季项目男性精英运动员与普通运动员间的睾酮浓度无显著性差异（P=0.622），而冬季项目女性精英运动员的睾酮浓度显著高于女性普通运动员（P=0.023）。Aa基因型的结果类似，表现为冬季项目男性精英运动员与普通运动员间的睾酮浓度无显著性差异（P=0.551），而冬季项目女性精英运动员的睾酮浓度显著高于普通运动员（P=0.039）（表5）。

2.5 ACADSB基因6个SNPs的功能注释

3 讨论

本研究首先分析了冬季项目不同运动等级运动员睾酮水平的差异和分布，然后通过GWAS方法发现了413个具有显著性的SNPs，其中ACADSB基因上6个SNPs具有全基因组显著性水平。基因频率分布分析发现，ACADSB基因上6个SNPs的纯合替代基因型（aa）的分布频率最高，杂合基因型（Aa）次之，纯合参考基因型（AA）的分布频率最低。在冬季项目的男性运动员中，ACADSB基因6个SNPs的aa基因型的睾酮浓度显著高于Aa基因型，但在女性运动员中无差异。最后的SNPs功能注释分析提示，这些SNPs在10号染色体上具有共同的3D互作基因。

3.1 冬季项目运动员睾酮水平分布范围和个体差异

睾酮是冬季项目运动员的一项重要生化监控指标。睾酮作为一种重要的雄激素，对男性和女性的生理系统都有广泛的影响。在骨骼肌肉系统，睾酮能够增加肌肉蛋白质的合成，这有利于力量和爆发力素质的提升。研究发现，睾酮对正常男性具有显著的促进肌肉生长和增强肌肉力量的作用，这种作用在无额外运动的情况下即可显现，而且与运动相结合时效果更为显著（Bhasin et al.，1996）。睾酮水平的升高有助于改善心肺功能和提升无氧代谢能力，双变量相关性分析表明，无论是处于正常体重、超重还是肥胖状态，男性睾酮水平和最大摄氧量之间都存在显著的正相关（Hosick et al.，2020）。此外，睾酮水平的提升还能改善运动员的心理状态，有助于运动员在比赛中发挥出更好的水平（Casto et al.，2016）。

睾酮水平作为评估冬季项目运动员身体机能和竞技状态的重要指标，睾酮浓度的变化可能跟运动强度有关。研究发现，两天100 km的滑雪后，男性越野滑雪运动员睾酮水平下降了20%以上，皮质醇水平升高2.3倍（Vaananen et al.，2004）。也有研究报道，优秀国家队滑雪运动员男性运动员在50 km比赛后睾酮水平无变化，而女性运动员比赛后睾酮水平升高1.25倍（Ronsen et al.，2004）。睾酮皮质醇比值是优秀速度滑冰运动员的敏感生物标志物（Banfi et al.，1993）。尽管这些研究报道了运动员的睾酮水平和睾酮在运动监控中的重要作用，但是样本量均较小。鲜有研究报道大样本冬季项目运动员的睾酮水平分布特征。本研究发现，冬季运动项目精英运动员的睾酮水平显著高于普通运动员，这一发现与他人的研究观点相吻合，即较高的睾酮水平对提升运动表现具有积极作用（ Bezuglov et al.，2023；Wood et al.，2012）。同时我们也发现，冬季项目运动员睾酮水平低于研究报道的田径项目运动员的睾酮水平（Bezuglov et al.，2023），但鉴于运动员群体、实验控制等因素的影响，这一差异需要进一步的验证。此外，我们还发现，从个体差异角度来看，精英运动员的睾酮水平并不总是高于普通运动员。这提示睾酮水平只是决定运动表现的一个因素，其在不同运动等级运动员间的差异反映了训练效果和生理适应的不同阶段。

睾酮水平的差异受性别、年龄、运动、营养等多种因素影响。在性别中表现为男性睾酮水平高于女性，临床上成年男性睾酮的正常值范围通常在14.0～25.4 nmol/L，而成年女性的睾酮正常值一般在1.3～2.8 nmol/L。睾酮水平虽然受年龄影响，但通常在青春期达到高峰，在成年期保持相对稳定。值得注意的是，本研究通过对比分析发现，无论男女，冬季项目运动员群体的睾酮水平波动范围相较于一般成年人群更为宽泛。研究报道，在正常健康的人群中（包含运动员），睾酮水平呈明显的双峰分布，男性范围的下限比女性范围的上限高出4～5倍（男性8.8～30.9 nmol/L，女性0.4～2.0 nmol/L）（Clark et al.，2019），这与本研究结果一致。运动对于睾酮浓度的影响较为复杂，存在不一致的研究结果。有研究发现，10周的力量训练可以显著提升年轻（30岁）受试者的d血清游离睾酮浓度，而对老年（60岁）受试者的血清游离睾酮浓度无影响（Kraemer et al.，1999）。也有研究报道，12周渐进性阻力力量训练并未增加年轻（23岁）和老年（63岁）受试者的睾酮水平（Craig et al.，1989）。Meta分析也发现，运动训练（力量训练、有氧训练）不会影响活动不足、性腺功能正常男性的静息总睾酮浓度或游离睾酮浓度（Potter et al.，2021）。研究结果不同的原因可能与受试者、训练方案、实验控制等因素有关。例如，不同的营养策略可影响睾酮水平，蛋白质、脂肪、维生素及矿物质等营养素的摄入与睾酮的合成和代谢密切相关（Whittaker，2023 ，Wrzosek et al.，2020）。4周35.0 mg/kg/天的钙补充量（Cinar et al.，2009），8周1.8 g/kg/天的乳清蛋白补充量（Arazi et al.，2011）可以显著提高运动员的睾酮水平，而高于3.4 g/kg/天的蛋白补充量则可能对睾酮水平有负面影响（Whittaker，2023）。负荷强度也会影响睾酮水平，有研究报道，3组6次重复的下肢练习，当负荷为100%的6 RM时，睾酮水平显著上升，而负荷为70%～76%的6 RM时并未引起睾酮水平的显著变化（Vingren et al.，2010）。

3.2 冬季项目运动员睾酮水平相关的遗传多态性

3.3 ACADSB基因上6个与冬季项目运动员睾酮水平相关SNPs的生物功能注释

本研究首次报道了ACADSB基因上的6个SNPs与中国冬季项目运动员的睾酮水平相关。ACADSB基因被定位到染色体10q26.13，包含11个外显子，编码包含432个氨基酸的SBCAD前体蛋白，该蛋白是酰基辅酶A脱氢酶家族的成员，并且作为一种线粒体酶，可催化脂肪酸或支链氨基酸代谢中酰基辅酶A衍生物的脱氢作用（ Arden et al.，1995；Rozen et al.，1994），ACADSB在细胞能量产生和代谢中扮演着重要角色。此外，ACADSB还与一些癌症细胞的迁移、侵袭、增殖以及预后相关（ Lin et al.，2023；Lu et al.，2020）。短/支链酰基辅酶A脱氢酶缺乏的儿童容易出现智力障碍、肌肉萎缩、张力减退、癫痫和自闭症等（ Kanavin et al.，2007；Porta et al.，2019）。

从现有的生物学知识和文献报道来看，ACADSB基因及其编码的SBCAD并不直接参与睾酮的合成途径。睾酮的合成是一个复杂的生物化学过程，主要由类固醇合成途径中的酶和蛋白质调控，与脂肪酸代谢途径中的酶（如SBCAD）无直接联系。虽然ACADSB基因不直接参与睾酮的合成，但其编码的SBCAD在脂肪酸代谢中的作用可能对睾酮的合成产生间接影响。在疾病模型中，基因集富集分析显示，脂肪酸代谢在ACADSB高表达表型中显著富集，表明ACADSB在脂肪酸的分解和利用过程中起着重要作用（Liu et al.，2021），而脂肪酸代谢可通过为类固醇激素合成提供原料，调节胰岛素代谢等多种机制影响睾酮水平。例如，在Leydig细胞中，高表达脂肪酸去饱和酶2促使细胞内积累含有Omega-6高度不饱和脂肪酸的胆固醇酯，这些胆固醇酯是激素敏感性脂肪酶合成睾酮的优先底物（Ri et al.，2022）。脂肪酸代谢影响胰岛素的分泌，研究发现，在女性体内胰岛素可激活胰岛素受体，并通过肌醇糖苷介导的信号转导促进卵巢颗粒细胞中的睾酮合成（Nestler et al.，1998）。一些脂肪酸，尤其是ω-3脂肪酸，已被发现能够增加睾酮的分泌（Abbott et al.，2020）。较高的饱和脂肪酸摄入量也被证实与较高的血清总睾酮和游离睾酮浓度相关，其代谢的紊乱影响胆固醇的代谢和转运，进而可能影响睾酮的合成原料供应（Wynne-Ellis et al.，2024）。尽管有这些发现，但现有证据中，ACADSB通过脂肪酸代谢对睾酮水平产生的影响是间接的、复杂的，需要进一步的实验证据来支持。

3.4 研究局限性

本研究存在一定局限性。首先，尽管本研究的样本量已覆盖广泛的冬季项目运动员，并通过统计方法有效控制了群体分层的影响，但GWAS分析通常要求更大的样本量来全面揭示遗传变异的复杂性和提高统计效力。因此，未来研究应致力于进一步扩大样本规模，以期发现更多低频或罕见的基因变异位点，为冬季项目运动员睾酮水平相关的遗传基础提供更为全面的见解。其次，睾酮水平及其前体物质（如雄烯二酮二硫酸盐）的调节是一个复杂的过程，涉及训练强度、营养摄入、环境条件（如训练、营养、比赛压力等）以及个体遗传背景等多种因素的相互作用。本研究未能深入探究这些多因素之间的具体交互作用机制。未来的研究应综合考虑并量化这些因素的综合影响。此外，虽然本研究对ACADSB基因上6个SNPs进行了功能注释，但仍需进一步的实验证据来支持其直接关联和因果关系。未来研究应综合利用生物信息学工具、细胞实验及动物模型等方法，深入探究SNPs影响睾酮水平的分子机制，为冬季项目运动员选材和个性化训练提供更为坚实的科学依据。

4 结论

在冬季项目中，精英运动员的睾酮水平高于普通运动员。ACADSB基因上6个SNPs是新发现的与冬季项目运动员睾酮水平相关联的SNPs，aa基因型男性冬季项目运动员的睾酮浓度高于Aa基因型男性冬季项目运动员。返回搜狐，查看更多